CARIOTIPO EN SANGRE PERIFERICA

Introducción

¿Qué es un cariotipo?

Un cariotipo es el conjunto de cromosomas, con sus características,número y forma propios de cada especie.

Los cromosomas humanos son estructuras organizadas que se encuentran en el núcleo de las células y contienen la información genética del individuo. Están compuestos por ADN e histonas, y adquieren esa forma durante la mitosis, en la fase donde ocurre la máxima condensación del ADN, la metafase.

En la especie humana el numero de cromosomas es de 46, los cuales 44 son autosomas y 2 son cromosomas sexuales, XX en mujeres e XY en hombres, los 44 autosomas corresponden a 22 parejas de cromosomas homólogos. Excepto que se produzca alguna anomalía en el numero de cromosomas como trisomias o monosomias. Como por ejemplo el síndrome de Down (trisomía 21). síndrome de Klinefelter (47,XXY), etc, ademas existen otras anomalías como deleciones como en el síndrome de maullido de gato, traslocaciones reciprocas, robertsonianas, etc

MATERIAL

• Muestras de sangre en heparina
• Cloruro potasico (KCl)
• Ácido acético Glaciar
• Metanol
• Pastillas de buffer pH 6,8
• Fitohemaglutinina
• Suero fisiologico
• Giemsa
• Colchicina
• Tripsina
• Agua destilada
• Medio de cultivo enriquecido
• Pipetas Pasteur de 3 mL (posteriormente habrá que rotularlas)
• Bote de 100 mL

DÍA 1: SIEMBRA DE SANGRE PERIFÉRICA

El primer día de esta practica realizamos dicha siembra, para ello debemos obtener una muestra de alguna persona de nuestro grupo de prácticas.

Para iniciar cada grupo descongelará dos tubo de medio de cultivo y lo identificara con su numero de grupo, dicho medio ya viene preparado.

La descongelación lo hicimos metiendo en la estufa el medio de cultivo durante una hora a 37 ºC

Mientras, nos dispusimos a la extracción de sangre periférica por medio de una lanceta y se extrajo con capilares, luego la pusimos en un tubo eppendorf, solo se pudo realizar correctamente a una persona de nuestro grupo, ya que a los demás no les salio suficiente cantidad de sangre como para llenar dichos capilares.

Se produjo una extracción venosa a otra compañera de clase.

Cuando el tubo se descongeló al pasar el tiempo necesario, añadimos con una micropipeta:

_0,25 mL de fitohemaglutinina (la cuál no fue necesario descongelar en la estufa, sino que se descongelo a temperatura ambiente), la fitohemaglutinina sirve para parar la división antes de que se produzca la anafase, es una lecitina.

_ 0,4 mL de sangre completa, agitando antes de pipetear la sangre

Agitamos para mezclar y mantener el tubo en la estufa a 37ºC durante 72 horas

_Este día tambien realizamos cada grupo un reactivo de los 5 necesarios, nosotros hicimos la solución de KCl, para ello usemos 0,56 g de KCl con 100 mL de agua destilada y lo disolvimos. (Dicho producto puede almacenarse durante 15 dias a 4ºC.

KCl ya preparado, se indica grupo y fecha
en que se realizó.

Pesamos 0,56 gramos en la balanza.

DÍA 2: SACRIFICIO DE LA SANGRE

Añadimos con la micropipeta en el tubo de siembra 0,25 mL de colchicina (sirve para que el huso cromático desaparezca, debe manipularse con cuidado), agitar suavemente y dejarlo 45´en la estufa a 37 ºC. La colchicina estaba en el congelador y tuvimos que meterla en el baño.
Luego centrifugar el tubo 5´a 1000 rpm. Cuando finalice, se elimina el sobrenadante (dejamos un poco para no llevarnos el pellet) con la pipeta Pasteur de trabajo (A) y echar el desecho en el bote de residuos.
En este momento metemos el portaobjetos con agua fría en la nevera

Las pipetas pasteur las nombremos así:
A- Pipeta de trabajo
B- Pipeta para rellenar.
C-Pipeta limpia

Después con la pipeta B añadimos 10 mL(por cada grupo, ya que cada grupo tiene 2 tubos de siembra) de KCl del bote, provocando que se produzca la lisis celular de eritrocitos y que los linfocitos se hinchen, para ello se siguen estos pasos:

1. Primero añadimos 1 mL, pipeteamos y mezclamos despacio con la pipeta A, es muy IMPORTANTE deshacer por completo el botón de precipitación, mediante pipeteo
2. Luego añadimos otros 4 mL despacio con la pipeta B, a la vez se va pipeteando con la pipeta A para que se mezclen, con cuidado. (Un exceso de tiempo puede provocar que los cromosomas se dispersen y las metafases aparezcan incompletas y mezcladas entre ellas, no detenerse en este punto para evitar la lisis celular.

Después realizamos una segunda centrifugación del tubo durante 5`a 1000 rpm. Cuando finalice, se elimina el sobrenadante con la pipeta A y echar el desecho al bote de residuos, dejando mas o menos 0,5 mL en el tubo. Hay que tener precaución de no quitar el botón de precipitación cuando se retira el sobrenadante.

Tras esto se añade con la pipeta C 1 mL de fijador de Carnoy (Ácido acético y etanol). Esta solución se debe resuspender bien con la pipeta A muy despacio. Luego añadir con la pipeta C poco a poco 4 mL de fijador, resuspender con A.

Después centrifugar 5`a 1000 rpm (3ª centrifugación) Se repiten estos dos últimos pasos dos o 3 veces en total hasta que esté limpio y blanco el precipitado El sobrenadante debe quedar transparente. En nuestro caso la primera vez no quedo bien limpia y tuvimos que repetir el proceso.

Quitamos el sobrenadante con la pipeta A dejando aproximadamente 0,5 mL y se resuspende bien con la pipeta A

Por último se hacen las extensiones en los portaobjetos limpios numerados, y se echan 4 ó 5 gotas con la pipeta A a diferentes distancias dejando resbalar las gotas inclinando sobre el portaobjetos para que se extienda por toda la superficie. En nuestro caso fueron cuatro portaobjetos y lo hicimos con alturas diferentes y distinto número de gotas:

1. Portaobjeto 1: 10 cm 4 gotas
2. Portaobjeto 2: 20 cm 2 gotas
3. Portaobjeto 3: 20 cm 6 gotas
4. Portaobjeto 4: 10 cm 4 gotas

Extensión.

DÍA 3: BANDEO Y TINCIÓN DE CROMOSOMAS

Preparamos la solución de bandeo mezclando el microtubo con tripsina (colorea los cromosomas en dos regiones, claras y oscuras, las oscuras son de replicación tardía rica en A y T) previamente descongelada con el buffer. Se usó un vaso de precipitados para introducir bien los portaobjetos
Introducimos el porta en la tripsina durante unos segundo, en nuestro caso hicimos distintos tiempos.

1. Portaobjetos 1: 4 segundos
2. Portaobjetos 2: 6 segundos
3. Portaobjetos 3: 4 segundos
4. Portaobjetos 4: 6 segundos

Se amortiguará la acción de la tipsina introduciendo inmediantamente el porta en solución tampón de pH 6,8 contenida en un vaso de precipitados (en caso de que se realizase el bandeo el mismo día de la fijación hay que disminuir el tiempo de tripsina 2 segundos)

A continuación se prepara la solución de tinción , echando 10 mL de Giemsa durante 2 minutos

Se lava el porta con agua, usemos agua destilada colocando los porta sobre unas paralelas sobre un barreño.

Se deja secar y ya está listo para observar al microscopio.

ANÁLISIS AL MICROSCOPIO

Se visualizan las extensiones con el objetivo de 10x, para buscar metafases, Una vez se ha localizado una, se coloca la misma en el centro del campo de visión, se gira el objetivo y se añade una gota de aceite de inmersión a la preparación, después se cambia el objetivo a 100x y se vuelve a enfocar moviendo solo el micrométrico.

La observación de las metafases consiste en contar el número de cromosomas y comprobar que no tienen ninguna aneuplodía. Identificar algunos de los cromosomas mas sencillos por su gran tamaño como el 1,2 y 3 y también la posición del centrómero, el cromosoma 7 tiene un bandeo característico o el cromosoma 21 e Y por ser los más pequeños.

Aunque en un inicio nos costó enfocar porque fue la primera vez que experimentemos con medio de inmersión, finalmente se consiguieron ver los cromosomas.