TINCIÓN DE CROMOSOMAS EN CÉLULAS CANCERÍGENAS PREFIJADAS

OBJETIVO DEL EXPERIMENTO

 En este experimento vamos a utilizar la tinción de Giemsa para examinar el cariotipo de células cancerígenas. Las células han sido fijadas en portaobjetos en metafase permitiéndonos teñir y observar los cromosomas condensados. Se desarrollará el conocimiento del cariotipo y la asociación de anomalías cromosómicas con enfermedades.

COMPONENTES 

(Todos ellos deben conservarse a temperatura ambiente:

• Portaobjetos con células fijadas 
• Tinción GIEMSA 
• Medio de Montaje 
• Cubreobjetos 
• Microtubos
• Micropipetas

 Material requerido y no suministrado:

• Microscopio con (400 o 1.00X). 
• Vasos. 
• Agua destilada.
• Pinzas.
• Papel absorbente. 
• Guantes. 

INFORMACIÓN GENERAL 

CROMOSOMAS 

Los cromosomas, las hebras de ADN condensada y proteínas, se encuentran en el núcleo de casi todas las células de nuestro cuerpo. Cada cromosoma se compone de ADN de doble cadena que está estrechamente envuelta alrededor de proteínas conocidas como histonas, formando un complejo conocido como cromatina .Esta disposición de la cromatina es esencial para el empaquetamiento de las moléculas de ADN; el ADN sin empaquetar es demasiado largo para caber en el núcleo y se podría dañar. En lugar de ello, los cromosomas permiten que las células eucariotas almacenen de forma compacta el ADN, reduciendo en gran medida la longitud total. Además de proporcionar estructura, los cromosomas ayudan a regular la expresión génica ocultando o el descubrimiento de segmentos de ADN, alterando la velocidad de transcripción de genes individuales.

LAS ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS CONDUCEN A ENFERMEDADES

 Las variaciones en el complemento normal de cromosomas se han asociado con numerosas enfermedades prenatales. Esto puede incluir alteraciones numéricas, donde los cromosomas están mal, aumentaron o disminuyeron o alteraciones estructurales tales como deleciones, duplicaciones y translocaciones. Aproximadamente el 0,5% de todos los nacidos vivos se asocian con algún tipo de anomalía cromosómica.

Los fenotipos provocados por las anomalías cromosómicas son muy variables pero en casi todos los casos se asocian con retraso en el desarrollo y retraso mental, alteraciones faciales y determinadas malformaciones congénitas.

DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO 

Las células utilizadas en este experimento es una línea celular inmortalizada de leucemia mieloide crónica que ha sido crecida en laboratorios durante décadas, contribuyendo a su inestabilidad genómica. Por tanto, estas células presentan un cariotipo anormal, el cromosoma Philadelphia, una segunda translocación entre el cromosoma 15 y 17, y un total de 68 cromosomas. Los cariotipos han conseguido ser la principal herramienta en la detección de enfermedades cromosómicas. Para realizar un cariotipo, as células son cultivadas por un periodo breve de tiempo en el laboratorio y luego son tratadas con colchicina que inhibe la formación de microtubos y la división celular es detenida en la metafase. Estas células luego son fijadas y adheridas a portaobjetos de microscopio. Y finalmente lse prodúcela tinción con Giemsa, una mezcla de colorantes que selectivamente tiñe de azul el ADN permitiendo visualizar los cromosomas al microscopio. En este experimento los estudiantes se familiarizarán con los principios básicos dela microscopía y el estudio de los cromosomas. Precauciones:

Llevar gafas y guantes de laboratorio mientras se trabaja.

NO PIPETEAR CON LA BOCA, utilizar los dispositivos adecuados.

Lavarse las manos con jabón y agua después de haber trabajado en el laboratorio. 

Sino estas seguro de alguna cosa, PREGUNTA A TU INSTRUCTOR

PRÁCTICA

PREPARACIONES PREVIAS

1. Marcar 12 microtubos de la siguiente forma: a) 6 microtubos GIEMSA; b) Medio de montaje.

2. Añadir 7 ml de agua destilada al bote con GIEMSA concentrado y mezclar por inversión. 

3. Dispensar aproximadamente 1 ml de cada reactivo al microtubo correspondiente. 

4. Preparar vasos con agua destilada para lavar las preparaciones. 

5. Distribuir una preparación por grupo, 1 cubreobjeto, 2 micropipetas, 1 vaso con AD.

TINCIÓN 

1. Añadir 10 gotas o 250 ul de la tinción GIEMSA en el área del portaobjetos que contiene la extensión de células en metafase. Agitar muy suavemente en círculos pequeños de forma que quede cubierto toda el área.

2. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.

3. Eliminamos la tinción sobrante aspirando con la micropipeta, aunque también se puede hacer con una pipeta pasteur y sumergir cuidadosamente la preparación en el vaso que contiene el agua destilada durante 30 segundos. Se recomienda colocar el portaobjetos sobre un folio blanco que haga contraste para observar la tinción azul.

4. Secamos a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Para eliminar todo el agua, inclinamos el portaobjetos para recoger el agua en un extremo y ayudarse con la punta de papel secante. En ningún caso aplicar el papel secante en el circulo ya que se eliminaría las células. 

5. Utilizando una micropipeta, añadir 1 o 2 gotas de medio de montaje a las células teñidas.

6. Cuidadosamente colocar un cubreobjetos encima del medio de montaje. Evitar la formación de burbujas. Si hay burbujas presionar muy suavemente para desplazarlas.

OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO

1. Utilizar un microscopio de campo claro. El objetivo de inmersión ayudará en la correcta visión de los cromosomas. Utilizar el objetivo 10x o 20X y buscar un campo bien teñido para localizar las mejores metafases.

 2. Mover al objetivo de 40X 0 100X y contar el número de cromosomas en el campo observado. Tomar nota de las características de los cromosomas incluyendo la presencia de centrómeros o estructuras anormales de cromosomas, si la célula contiene cromosomas individuales o en parejas, y otras observaciones.
3. Buscar otro diferente campo o células y repetir las observaciones por 4 veces más.
Cabe añadir que es la primera vez que se realizó la observación con medio de inmersión, utilizamos aceite como medio.