ADN/ARN MICROARRAY

• OBJETIVO

 En primer lugar decir que esta practica diseñada con el fin de analizar diferencias en la expresión génica utilizando un microarray de dos colores. Se analizaron cuatro conjuntos de muestras simuladas de pacientes para determinar diferentes niveles de expresión génica. 

La tecnología de microarrays de dos colores permite la comparación de los perfiles de expresión de dos muestras diferentes (por ejemplo, células de la piel normal frente o células de cáncer de piel). 

• PROCESO DE UNA MICROARRAY

Hay cuatro pasos básicos que intervienen en un microarray de dos colores.

1.  Preparación de muestras: El ARNm total se extrae de las muestras control y experimentales.
2. Síntesis de ADNc: Se generan bibliotecas de ADN complementario (ADNc) a partir de las muestras de ARN usando transcriptasa inversa (RT), una enzima que utiliza ARN como molde para producir ADN. Las bibliotecas de ADNc son etiquetados con sondas fluorescentes. El ADNc aislado de la muestra control es marcado con una etiqueta fluorescente verde normalmente, mientras que cDNA aislado de la muestra experimental se marca con un fluorescente rojo. 
3. La hibridación: El cDNA marcado a partir de muestras control y experimentales se coloca en el chip micromatriz, donde se une (o se hibrida) con el punto que contiene el oligo con una secuencia complementaria. Estos resultados de hibridación da lugar a una hélice de doble cadena de ADN estable. Después de la hibridación, el chip se lava varias veces para eliminar cualquier ADNc que no se ha unido a un oligo en el chip. 
4. Búsqueda y Análisis de Datos: El chip se escanea con un láser que excita los marcadores fluorescentes. La información de la fluorescencia en cada punto se recoge y se procesa mediante un programa especializado que crea una imagen en color de la micromatriz. La imagen se analiza utilizando un programa que interpreta la fluorescencia de cada punto.

El color y la intensidad de fluorescencia en cada punto nos permite identificar diferencias genéticas clave, como las que existen entre las células normales de la piel y las células de cáncer de piel. La biblioteca de cDNA control representa el nivel normal de expresión de genes en células de la piel. Si sólo se hibrida la biblioteca del control en nuestro microarrays, diferentes puntos aparecerían con diferentes intensidades de color verde. Así pues podemos obtener que:

• Manchas verdes brillantes: indican los puntos que han capturado los niveles altos de ADNc (lo que sugiere un alto nivel de expresión), y manchas verdes débiles o negras sugieren que hay una baja (o no hay) expresión de ARNm. A la inversa, si el mismo chip se hibridó exclusivamente con la biblioteca de ADNc de cáncer de piel, se ven diferentes intensidades de color rojo. Cuando las dos bibliotecas se hibridan simultáneamente para el mismo chip, se espera que aparezcan cuatro colores en el análisis, los colores negro (sin expresión), verde, rojo o amarillo. Aparecen manchas amarillas cuando el control y las muestras experimentales se hibridan en cantidades equivalentes. 
• Cuando aparece un punto verde nos indica la presencia de más de ADNc a partir de la muestra de control (sanos) que de la muestra experimental (célula enferma). Por lo tanto, un punto verde revela que hay menos mRNA presente en la célula de cáncer de lo normal, y el gen se dice que tiene una "baja expresión". Por el contrario, una mancha roja significaría que el gen tiene una "elevada expresión" en la muestra del cáncer

• DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO:

En esta práctica, vamos a analizar cuatro conjuntos de muestras simuladas de pacientes para determinar diferentes niveles de expresión génica. Al venir esto ya preparado no es necesario realizar las fases de prehibridación e hibridación y lavado puesto que ya venia preparado.

• PRECAUCIONES

1.  Llevar gafas y guantes de laboratorio mientras se trabaja.
2.  NO PIPETEAR CON LA BOCA, utilizar los dispositivos adecuados. 
3. Extremar las precauciones cuando se trabajan con equipos que utilizan conjuntamente calor y mezcla de reactivos. 
4. Lavarse las manos con jabón y agua después de haber trabajado en el laboratorio o utilizado reactivos o materiales biológicos.

• PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES: 

Para esta práctica disponemos de  16 muestras diferentes (cuatro por paciente) han sido antes convertidos en ADNc en presencia de un marcador fluorescente incorporado durante la síntesis. Las bibliotecas de ADNc de pacientes se mezclan previamente con el ADNc marcados obtenidos a partir de células normales de control. Así pues nuestro objetivo era poder observar las muestras de las tarjetas de microarrays en el orden establecido para cada paciente. Los puntos de muestreo de las tarjetas contienen fragmentos de ADNc sintetizados (por PCR) para cada uno de los ARNm de los pacientes. Las primeras cuatro muestras en cada microarray QuickStrip (A a D) son muestras de control, seguidas de cuatro muestras de pacientes (E a H).

• MATERIAL NECESARIO:

• Cuatro tiras de Microarrays QuickStrip diferentes (correctamente marcadas)
• Micropipeta fija de 5 µL.
• Puntas de pipeta. 
• Fuente (linterna o transiluminador) de luz U.V. onda larga (luz negro).
• Vaso de precipitados.

• PRÁCTICA

1. Cogimos una tarjeta de microarrays. (una por grupo)

2. Coger cuatro microarray QuickStrip individuales con las muestras de ADNc codificados para los pacientes 1, 2, 3 y 4.

 Las muestras de microarrays se marcaron de la siguiente forma:

 Paciente 1 (una línea), Paciente 2 (dos líneas), Paciente 3 (tres líneas), Paciente 4 (4 líneas)

Cabe recordar que para obtener resultados correctos, es esencial la precisión en el pipeteo y mantener las muestras de pacientes individuales en el orden correcto. La técnica de microarrays detecta aumentos o descensos en la regulación de los genes basándose en la expresión del ARNm de la célula. El ARNm de genes específicos del paciente se convierte en cDNA y están asociados a un marcador fluorescente de color rojo. Las dos muestras (ADNc de pacientes y de control) se mezclan y se hibridan a un chip de genes de microarray. Después de la hibridación, el chip de genes de microarrays es leen con un escáner de fluorescencia inducida por láser. La información obtenida desde el chip se almacena en un ordenador y se analiza usando un programa que específico que interpreta los datos del microarrays. 

La preparación inicial de la práctica sólo requiere la separación de los grupos de muestras en tiras, ya que todo lo anterior viene preparado anteriormente.

3. Cogimos un rotulador para marcar (con líneas) al final de cada tira de Microarray QuickStrip

4. Separamos con sumo cuidado las microarrays QuickStrips individuales con unas tijeras, procurando de no perforar la lámina que cubre las muestras. (teníamos cada grupo cuatro microarrays QuickStrip (una correspondiente a cada paciente) y comprobamos que están correctamente marcadas. 

5. Posteriormente como el líquido no se quedaba adherido al fondo golpeamos suavemente sobre la mesa de laboratorio la microarrays QuickStrip con el fin de que dichas muestras queden en el fondo y así sería más fácil su recogida.

6. Se entregó una tarjeta de microarrays para cada grupo. En dicha tarjeta, los puntos A-D representan muestras de control y los puntos E-H representan las muestras experimentales, en ella vamos a anotar los resultados obtenidos tras la lectura de los resultados.
7. Con la misma punta de la pipeta se perfora la lámina protectora que cubre los pocillos, se pipetea 5 μl y aplicamos cada muestra de ADNc en los lugares correctos identificados para cada paciente en la tarjeta.

Cabe añadir que en dos muestras de pacientes hubo problemas para pipetear la muestra ya que provenía con una cantidad tan inmensamente pequeña que fue imposible pipetearla, en otras se pudo pipetear pero una cantidad ínfima.
8. Colocamos la tarjeta en una incubadora a 37ºC durante cinco minutos para permitir que las muestras se sequen.

9. Una vez transcurrido dicho tiempo visualizamos los resultados de la tarjeta utilizando un transiluminador UV de onda larga.

Los colores se ven mejor en vivo, ya que al capturar la imagen ésta pierde
bastante calidad.

• VISUALIZACIÓN DE LOS RESULTADOS.

Usando los símbolos apropiados en cada caso, anotamos los resultados en la tarjeta de

muestras de microarrays. Los símbolos que se emplearon fueron los siguientes:

N ⇒  Expresión normal (naranja).

-   ⇒  Sin expresión (negro).

↑  ⇒   Expresión elevada (rojo).

↓  ⇒   Expresión baja (verde).

Lectura de los resultados obtenidos mediante símbolos establecidos, las dos muestras E en blanco
 no se pudieron pipetear correctamente debido a la poca cantidad de muestra presente en los pocillos.

DETERMINACIÓN DEL FACTOR RH POR PCR

¿QUÉ ES EL FACTOR RH?

El factor Rh es una proteína integral de la membrana de los glóbulos rojos y que también sirve para detectar su tipo de sangre ya sea A+ o A- o los demás tipos.

Los Rh positivos son aquellas personas que presentan dicha proteína en su Rh, y negativa quienes no presenten la proteína. Un 85 % de la población tiene en esa proteína una estructura dominante, que corresponde a una determinada secuencia de aminoácidos que en lenguaje común son denominados habitualmente Rh+.

Alrededor de la sexta semana de gestación, el antígeno Rh comienza a ser expresado en los glóbulos rojos humanos.

Tener Rh– significa que se tiene la misma proteína pero con modificaciones en ciertos aminoácidos que determinan diferencias significativas en la superficie de los glóbulos rojos, y hacen a los humanos Rh– disponer de anticuerpos (aglutininas) en el plasma que reaccionan contra los glóbulos rojos Rh+.1​

El principal antígeno Rh es el D y el anticuerpo presente en quienes carecen de antígeno D es el anti-D. Si el antígeno D está presente el fenotipo es Rh positivo y si D está ausente (situación representada como "d") es Rh negativo. Se han identificado más de 45 antígenos del sistema Rh, pero de todos ellos apenas cinco son frecuentes, estos son: D, C, E, c, e. Los anticuerpos a los distintos antígenos Rh aparecen después de exponerse un individuo Rh negativo a eritrocitos de sangre Rh positivo. La herencia de los antígenos Rh es determinada por un complejo de dos genes, de los cuales uno codifica la proteína transportadora de antígeno D y otro codifica la proteína transportadora de antígeno «C» o «c», o de «E» y «e». Las personas Rh positivas poseen genes RHD, que codifica la proteína transportadora de antígeno D y RHCE, que codifica la especificidad de la proteína transportadora de C y E. Mientras las Rh negativas tienen únicamente el gen RHCE.

OBJETIVO DEL EXPERIMENTO.

Nuestro objetivo es determinar el Rh utilizando para ello la PCR y la electroforesis de ADN. Para realizar dicho proceso aislemos el ADN de nuestra saliva y lo usaremos para llevar a cabo la reacción de PCR, mediante la amplificación de un fragmento del gen D. Dicha amplificación determinará si la persona es Rh+ o Rh- 

El hecho de que los genes D y CE son altamente homólogos, es posible diseñar cebadores que se emparejan en una región del gen D y también en una región del gen CE. Así las personas Rh+ producirán 2 fragmentos de tamaños diferentes, uno de 1200 pb y otro de 600 pb correspondientes a los genes D y CE, en cambio, los individuos con Rh- producen solo un fragmento de 1200 pb correspondientes al gen CE.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

DÍA 1: EXTRACCIÓN DEL ADN.

PRÁCTICA DANAGENE SALIVA KIT

Material necesario:

• Reactivo de lisis celular.
• Reactivo precipitante de proteínas
• Reactivo hidratante para el ADN.
• Isopropanol.
• Etanol al 70%.
• Microtubos de 1,5 o 2 mL
• Centrífuga de alta velocidad o ultracentrífuga
• Agitador tipo vórtex
• Micropipeta y puntas.
• Baño de agua.

Cabe añadir que muchos de los compañeros ya tenían esta parte hecha, y tenían su ADN conservado en el congelador, pero debido al hecho de que algunos alumnos nos incorporamos más tarde al curso tuvimos que realizar esta práctica ahora. Puesto que al entrar los demás compañeros ya la habían realizado.

TOMA DE MUESTRA

Se depositó aproximadamente 1,5 mL de saliva en un vaso de precipitados, cabe recordar que no es recomendable comer durante los 30 minutos antes de la toma de la muestra, también es importante pasar la lengua con movimientos arriba y abajo por las paredes de las mejillas, paladar, etc para recoger las células.

• LISIS CELULAR

Lo primero que hicimos fue colocar 700 uL de saliva en un microtubo de 1,5 mL y se centrifugó en una ultracentrífuga durante 2 minutos a 14000 x g, luego se eliminó el sobrenadante con una micropipeta con sumo cuidado de no dañar el pellet blanco.

Luego se añadió 600 uL de tampón de lisis, se resuspendió con la micropipeta para disolver el pellet de células y lisarlo, hasta que este disuelto completamente sin que quedase ningún grumo blanco; el hecho de que queden grumos blancos hace que la cantidad de ADN que obtengamos será pequeña.

Incubamos durante 10 minutos en una incubadora-agitadora a 37ºC, esto nos permitió no tener que agitar los tubos durante dos minutos.

• PRECIPITACIÓN PROTEICA

Se añade 200 uL de tampón de precipitación de proteinas al lisado celular, luego se mezcla de forma vigorosa con un agitador tipo vórtex, a máxima velocidad durante unos 30 segundos.

Luego se centrifugó a 14000 x g durante 5 minutos, se debe de formar un precipitado, en nuestro caso al observarse partículas aún flotando se volvió a centrifugar y ya si se formó el precipitado.

• PRECIPITACIÓN DEL ADN

Primero se traspasó el sobrenadante que contiene el ADN a un microtubo eppendorf al que le echemos previamente 600 uL de isopropanol.

Luego se mezcló por inversión sobre unas 50 veces, y se volvió a centrifugar esta vez a 15000 x g durante dos minutos, tras ello y sacar los tubos de la ultracentrífuga se observó un pequeño pellet blanco. Seguidamente se eliminó el sobrenadante y se secó el tubo de forma breve, empleemos papel absorbente. Y se le añadió 600 uL de etanol al 70% para lavar el ADN.

Se invirtieron los microtubos en un papel absorbente y lo dejamos en esa posición durante unos 10 minutos aproximadamente.

• HIDRATACIÓN DEL ADN.

Se añadió unos 100 uL de tampón de hidratación y se resuspendió con la micropipeta, se le añadió poca cantidad ya que se obtuvo un pellet pequeño., y seguidamente se guardaron en el congelador ya que íbamos a hacer la amplificación del ADN  a la semana próxima y por lo tanto no se debía guardar en la nevera para tantos días.


DÍA 2: AMPLIFICACIÓN POR PCR.

MATERIALES:

• Mix PCR: Es una máster mix que ya contiene previamente mezclados todos los componentes de la PCR, con excepción del ADN molde, así pues contiene la ADN - polimerasa termoestable, los cuatro nucleótidos trifosfato, los dos cebadores, el tampón con Mg y un tampón de carga (con un agente densificante y un colorante)
• Control positivo
• Agua de biología molecular.
• ADN

PROCEDIMIENTO:

Antes de comenzar debemos tener en cuenta utilizar puntas con filtro y cambiar de punta cada vez que se realiza una acción para evitar contaminaciones que puede dar lugar a falsos resultados.

Lo primero que realizamos fue depositar 2,5 ul del ADN, que previamente extrajimos, en un tubo de 0,2 mL y se le añade 22,5 uL de mix PCR y se mezcla bien.  Para cada grupo se utilizó 4 muestras. Por lo que entre estas 4 muestras y el control positivo y negativo tendríamos 6 tubos de 0,2 mL por grupo.

También preparamos un control negativo de amplificación, el cual marquemos como -, para ello colocamos 2,5  µL de agua de biología molecular, esto sirve para saber si los reactivos o micropipetas y puntas pueden estar contaminados con ADN. En el control negativo no se ha de amplificar nada. Se le añade 22,5 µL de mix PCR y se mezcla bien.

Preparar un control positivo de amplificación, para ello colocar 2,5 µL del control positivo Rh+ en lugar del ADN, y 22,5 µL de mix PCR, se mezcla bien.

Lo siguiente es pasar al proceso de amplificación en el termociclador.

IMPORTANTE: Para la activación de la Polimerasa “HOT STAR” es necesario programar un paso de desnaturalización inicial de 10 minutos a 95ºC, después programar los 30 o 40 ciclos específicos de cada producto a amplificar. 

Ya se había programado el termociclador en días previos.
Los ciclos son los siguientes:

Desnaturalización HOT STAR ........... 95ºC .........10 minutos
Ciclos PCR Realizar 35 ciclos ............95ºC 64ºC 72ºC 30 segundos 30 segundos 45 segundos Extensión final.....................................72ºC......... 10 minutos
Final ....................................................4ºC......... tiempo ilimitado, hasta que se saquen las muestras del termociclador

Debemos recordar que dicha fase final es una fase de mantenimiento la cual consiste en una última incubación a 4ºC sin límite de tiempo para mantener las muestras hasta que se retiren del termociclador, anulando la actividad de la enzima.

DÍA 3: ELECTROFORESIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.

Materiales:

• Tampón TBE 1x
• Agarosa
• Colorante Blue blot
• Marcador de Pm (escalera de ADN)
• Tampón de carga
• Cubeta de electroforesis
• Fuente de alimentación
• Transiluminador
• Sistema de captación de geles.
• Tubos de 0,2 mL
• Micropipetas y puntas 

PROCEDIMIENTO:

Como pasaron varios días desde la preparación de nuestro gel de agarosa, el cuál estaba guardado en la nevera, ya se encontraba solidificado.
Lo primero que había que realizar era sacar el gel del molde, primero se retiró el peine, luego tuvimos el problema de que se quedó pegado por la parte de abajo y no se podía quitar, por lo que tuvimos que calentar agua en un vaso de precipitados para calentar la parte posterior del molde. Transcurridos unos minutos la parte de abajo se separó y se separó el gel del molde.

Luego se colocó el gel en la cámara de electroforesis con los pocillos orientados al lado más cerca del polo negativo (color negro).

Luego se llenó la cámara de electroforesis con tampón de electroforesis TAE 1x hasta cubrir el gel de agarosa y se produjo la siembra del gel.

El producto de la PCR puede ser sembrado directamente en el gel de agarosa después de la PCR, ya que el colorante rojo actúa como tampón de carga. (dicho colorante ya estaba incluido en la mix PCR).

Así pues realizamos la siembra, donde en el pocillo 1 se encuentra 5 µL de control positivo, en el pocillo 2 5 µL de control negativo, los pocillos 3,4,5,6 para las muestras (5 µL de cada una) , y un séptimo pocillo donde se depositó 5 µL de escalera de ADN (marcador de Pm).

Tras esto, conectamos la fuente de alimentación a 150 voltios durante 30 minutos, observándose al final de dicho tiempo que el colorante de carga se movió unos centímetros desde los pocillos.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.

Primero se desconecta la fuente de alimentación y se extrae y escurre el gel de agarosa, lo extrajimos con una hoja de plástico fino.
Luego se usó una tinción con blue blot, en el cual se mezcló 9,38 mL de éste, con agua destilada hasta llegar a los 125 mL.

Luego se dejó reposar dicho gel durante 10 minutos con el colorante.
Tras finalizar dicho tiempo, lo sacamos de ahí con cuidado y con ayuda de una cubeta lo enjuagamos debajo del grifo hasta que el agua dejase de salir azul.
Luego lo dejemos en remojo unos 20 minutos aproximadamente.

Tras ello, lo colocamos en el transiluminador, se tapa con el cono del sistema de captación  se encienden los aparatos.
Se enfocó hasta que se obtuvo la mejor resolución posible, pero no se observaban buenos resultados.

En cambio luego fijándonos en el gel y verlo al trasluz se podía ver bandas de ADN.

Podemos deducir que posiblemente se produjese algún tipo de error, bien problema del transiluminador, o bien por el colorante.