ADN/ARN MICROARRAY

• OBJETIVO

 En primer lugar decir que esta practica diseñada con el fin de analizar diferencias en la expresión génica utilizando un microarray de dos colores. Se analizaron cuatro conjuntos de muestras simuladas de pacientes para determinar diferentes niveles de expresión génica. 

La tecnología de microarrays de dos colores permite la comparación de los perfiles de expresión de dos muestras diferentes (por ejemplo, células de la piel normal frente o células de cáncer de piel). 

• PROCESO DE UNA MICROARRAY

Hay cuatro pasos básicos que intervienen en un microarray de dos colores.

1.  Preparación de muestras: El ARNm total se extrae de las muestras control y experimentales.
2. Síntesis de ADNc: Se generan bibliotecas de ADN complementario (ADNc) a partir de las muestras de ARN usando transcriptasa inversa (RT), una enzima que utiliza ARN como molde para producir ADN. Las bibliotecas de ADNc son etiquetados con sondas fluorescentes. El ADNc aislado de la muestra control es marcado con una etiqueta fluorescente verde normalmente, mientras que cDNA aislado de la muestra experimental se marca con un fluorescente rojo. 
3. La hibridación: El cDNA marcado a partir de muestras control y experimentales se coloca en el chip micromatriz, donde se une (o se hibrida) con el punto que contiene el oligo con una secuencia complementaria. Estos resultados de hibridación da lugar a una hélice de doble cadena de ADN estable. Después de la hibridación, el chip se lava varias veces para eliminar cualquier ADNc que no se ha unido a un oligo en el chip. 
4. Búsqueda y Análisis de Datos: El chip se escanea con un láser que excita los marcadores fluorescentes. La información de la fluorescencia en cada punto se recoge y se procesa mediante un programa especializado que crea una imagen en color de la micromatriz. La imagen se analiza utilizando un programa que interpreta la fluorescencia de cada punto.

El color y la intensidad de fluorescencia en cada punto nos permite identificar diferencias genéticas clave, como las que existen entre las células normales de la piel y las células de cáncer de piel. La biblioteca de cDNA control representa el nivel normal de expresión de genes en células de la piel. Si sólo se hibrida la biblioteca del control en nuestro microarrays, diferentes puntos aparecerían con diferentes intensidades de color verde. Así pues podemos obtener que:

• Manchas verdes brillantes: indican los puntos que han capturado los niveles altos de ADNc (lo que sugiere un alto nivel de expresión), y manchas verdes débiles o negras sugieren que hay una baja (o no hay) expresión de ARNm. A la inversa, si el mismo chip se hibridó exclusivamente con la biblioteca de ADNc de cáncer de piel, se ven diferentes intensidades de color rojo. Cuando las dos bibliotecas se hibridan simultáneamente para el mismo chip, se espera que aparezcan cuatro colores en el análisis, los colores negro (sin expresión), verde, rojo o amarillo. Aparecen manchas amarillas cuando el control y las muestras experimentales se hibridan en cantidades equivalentes. 
• Cuando aparece un punto verde nos indica la presencia de más de ADNc a partir de la muestra de control (sanos) que de la muestra experimental (célula enferma). Por lo tanto, un punto verde revela que hay menos mRNA presente en la célula de cáncer de lo normal, y el gen se dice que tiene una "baja expresión". Por el contrario, una mancha roja significaría que el gen tiene una "elevada expresión" en la muestra del cáncer

• DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO:

En esta práctica, vamos a analizar cuatro conjuntos de muestras simuladas de pacientes para determinar diferentes niveles de expresión génica. Al venir esto ya preparado no es necesario realizar las fases de prehibridación e hibridación y lavado puesto que ya venia preparado.

• PRECAUCIONES

1.  Llevar gafas y guantes de laboratorio mientras se trabaja.
2.  NO PIPETEAR CON LA BOCA, utilizar los dispositivos adecuados. 
3. Extremar las precauciones cuando se trabajan con equipos que utilizan conjuntamente calor y mezcla de reactivos. 
4. Lavarse las manos con jabón y agua después de haber trabajado en el laboratorio o utilizado reactivos o materiales biológicos.

• PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES: 

Para esta práctica disponemos de  16 muestras diferentes (cuatro por paciente) han sido antes convertidos en ADNc en presencia de un marcador fluorescente incorporado durante la síntesis. Las bibliotecas de ADNc de pacientes se mezclan previamente con el ADNc marcados obtenidos a partir de células normales de control. Así pues nuestro objetivo era poder observar las muestras de las tarjetas de microarrays en el orden establecido para cada paciente. Los puntos de muestreo de las tarjetas contienen fragmentos de ADNc sintetizados (por PCR) para cada uno de los ARNm de los pacientes. Las primeras cuatro muestras en cada microarray QuickStrip (A a D) son muestras de control, seguidas de cuatro muestras de pacientes (E a H).

• MATERIAL NECESARIO:

• Cuatro tiras de Microarrays QuickStrip diferentes (correctamente marcadas)
• Micropipeta fija de 5 µL.
• Puntas de pipeta. 
• Fuente (linterna o transiluminador) de luz U.V. onda larga (luz negro).
• Vaso de precipitados.

• PRÁCTICA

1. Cogimos una tarjeta de microarrays. (una por grupo)

2. Coger cuatro microarray QuickStrip individuales con las muestras de ADNc codificados para los pacientes 1, 2, 3 y 4.

 Las muestras de microarrays se marcaron de la siguiente forma:

 Paciente 1 (una línea), Paciente 2 (dos líneas), Paciente 3 (tres líneas), Paciente 4 (4 líneas)

Cabe recordar que para obtener resultados correctos, es esencial la precisión en el pipeteo y mantener las muestras de pacientes individuales en el orden correcto. La técnica de microarrays detecta aumentos o descensos en la regulación de los genes basándose en la expresión del ARNm de la célula. El ARNm de genes específicos del paciente se convierte en cDNA y están asociados a un marcador fluorescente de color rojo. Las dos muestras (ADNc de pacientes y de control) se mezclan y se hibridan a un chip de genes de microarray. Después de la hibridación, el chip de genes de microarrays es leen con un escáner de fluorescencia inducida por láser. La información obtenida desde el chip se almacena en un ordenador y se analiza usando un programa que específico que interpreta los datos del microarrays. 

La preparación inicial de la práctica sólo requiere la separación de los grupos de muestras en tiras, ya que todo lo anterior viene preparado anteriormente.

3. Cogimos un rotulador para marcar (con líneas) al final de cada tira de Microarray QuickStrip

4. Separamos con sumo cuidado las microarrays QuickStrips individuales con unas tijeras, procurando de no perforar la lámina que cubre las muestras. (teníamos cada grupo cuatro microarrays QuickStrip (una correspondiente a cada paciente) y comprobamos que están correctamente marcadas. 

5. Posteriormente como el líquido no se quedaba adherido al fondo golpeamos suavemente sobre la mesa de laboratorio la microarrays QuickStrip con el fin de que dichas muestras queden en el fondo y así sería más fácil su recogida.

6. Se entregó una tarjeta de microarrays para cada grupo. En dicha tarjeta, los puntos A-D representan muestras de control y los puntos E-H representan las muestras experimentales, en ella vamos a anotar los resultados obtenidos tras la lectura de los resultados.
7. Con la misma punta de la pipeta se perfora la lámina protectora que cubre los pocillos, se pipetea 5 μl y aplicamos cada muestra de ADNc en los lugares correctos identificados para cada paciente en la tarjeta.

Cabe añadir que en dos muestras de pacientes hubo problemas para pipetear la muestra ya que provenía con una cantidad tan inmensamente pequeña que fue imposible pipetearla, en otras se pudo pipetear pero una cantidad ínfima.
8. Colocamos la tarjeta en una incubadora a 37ºC durante cinco minutos para permitir que las muestras se sequen.

9. Una vez transcurrido dicho tiempo visualizamos los resultados de la tarjeta utilizando un transiluminador UV de onda larga.

Los colores se ven mejor en vivo, ya que al capturar la imagen ésta pierde
bastante calidad.

• VISUALIZACIÓN DE LOS RESULTADOS.

Usando los símbolos apropiados en cada caso, anotamos los resultados en la tarjeta de

muestras de microarrays. Los símbolos que se emplearon fueron los siguientes:

N ⇒  Expresión normal (naranja).

-   ⇒  Sin expresión (negro).

↑  ⇒   Expresión elevada (rojo).

↓  ⇒   Expresión baja (verde).

Lectura de los resultados obtenidos mediante símbolos establecidos, las dos muestras E en blanco
 no se pudieron pipetear correctamente debido a la poca cantidad de muestra presente en los pocillos.