OBJETIVO
Con esta práctica vamos a aprender el manejo de micropipetas para poder realizar de forma correcta y apropiada las técnicas que se emplean en cualquier laboratorio de análisis molecular, tales como la restricción enzimática, la PCR o la electroforesis.
Material necesario:
- Colorante I.(utilizamos Giemsa)
- Colorante II.(usamos eosina al 1%)
- Gradilla de 32 pocillos.
- Guantes.
- Micropipetas.
- Puntas desechables para micropipetas.
PROCEDIMIENTO
Se realizaron dos ejercicios prácticos, y la gradilla se distribuye en dos zonas, una para cada ejercicio.
Se realizará en la parte superior de la gradilla y se van a usar 16 pocillos para su realización, los pasos a realizar fueron los siguientes:
1. Pipetear 40 µL del Colorante I en el primer pocillo
2. De esos 40, pipetear 20 µL al segundo pocillo.
3. Del segundo pocillo pipetear 10 µL al tercero.
4. Del primer pocillo pipetear 10 µL al cuarto pocillo.
5. Repetir lo mismo en las otras tres columnas, para así acostumbrarnos al manejo de la micropipeta.
A continuación se añadió 20 µL de agua a cada pocillo, y pudimos observar que tenían el mismo color prácticamente puesto que el volumen final de colorante en cada pocillo es el mismo.
Se realizará en otra parte de la gradilla, se disponen de 16 pocillos para realizarlo.
1. Pipetear 80 μL del colorante II en el primer pocillo.
2. De esos 80 μL pipetear 40 μL al segundo pocillo.
3. Pipetear 20 μL del primer pocillo e introducirlo en el tercer pocillo.
4. Pipetear 20 μL del primero pocillo e introducirlo en el cuarto pocillo.
5. Pipetear 20 μL del segundo pocillo e introducirlo en el cuarto pocillo
6. Repetir lo anterior en las demás columnas.
A continuación añadimos agua, de esta forma:
En la primea columna 20 μL de agua
En la segunda fueron 30 μL
En la tercera 40 μL
Y en la cuarta 50 μL de agua.
De esta forma podemos observar un color resultante ligeramente distinto según la dilución que tengan.
OBSERVACIONES:
Es importante apoyar la mano al pipetear ya que nos dará una mayor estabilidad, precisión y rapidez en el pipeteo.
Cuando se quiera trabajar con cantidades muy pequeñas con las micropipetas hay que esperar un poco antes de sacarlo puesto que si no lo hacemos, nos podemos dejar cantidad sin coger.
Otro aspecto a tener en cuenta, es que no caiga el líquido que queramos dispensar en las paredes del tubo cuando sean cantidades muy pequeñas.
Además es muy importante hacer un doble enjuagado con el liquido que se va a utilizar para que de esta manera se consiga: Equilibrar la capa de líquido que se adhiere al interior de la punta, adaptar el aire que hay en la pipeta a la temperatura que tiene el líquido, y neutralizar los efectos de capilaridad.
PREGUNTAS:
- ¿Por qué es importante introducir la punta en el líquido con el primer tope del émbolo apretado?¿Por qué es importante sacar la punta del líquido con el segundo tope émbolo apretado? ¿Afectaría a la práctica el no hacerlo de esta forma?
Es importante por que si pulsamos el émbolo hasta el primer tope la micropipeta cogerá la cantidad de líquido que le hemos asignado.
Es importante apretar el segundo tope para que salga todo el líquido que habíamos pipeteado previamente, y no quede ningún resto en el interior.
Si afectaría, sobre todo cuando vamos a realizar cualquier experimento en el que tengamos que trabajar con volúmenes muy pequeños y precisos, puesto que si no pulsamos correctamente los topes en el momento que sea necesario se puede pipetear cantidad de menos, puede que entre aire, que no salga todo el líquido, etc, lo que puede dar lugar a una obtención incorrecta y que nos de un mal resultado del experimento o práctica.
- ¿Cómo son los volúmenes finales de los pocillos en el primer ejercicio en cada columna?
Los volúmenes finales de los pocillos en cada columna en el primer ejercicio son todos de 10 μL.
- ¿Qué volumen tiene el primer pocillo del segundo ejercicio al finalizar la práctica?¿Qué significa?¿Se ha pipeteado inicialmente la cantidad necesaria para hacer el ejercicio?
No queda nada finalmente en el primer pocillo
Ello es debido a que de los 80 μL iniciales se han ido pasando a los otros pocillos y finalmente no ha quedado nada.
Si se ha pipeteado la cantidad necesaria puesto que así lo marcaba nuestro ejercicio, con ello al echarle agua se puede ver como apenas está manchado puesto que queda vacío, solo se aprecia una pizca de color debido a pequeños restos que quedaron en las paredes del pocillo.
- ¿Qué volumen final tiene el cuarto pocillo del segundo ejercicio respecto al tercero? ¿A simple vista habrías asegurado lo mismo? Explica el por qué de este efecto visual.
El tercer y cuarto pocillo tienen un volumen final ambos de 20 μL.
No se habría dicho lo mismo a simple vista, el efecto visual es debido a que el tercer pocillo se encuentra más cerca del segundo que está mas lleno y entonces parece apreciarse con más colorante cuando en realidad no es así.
- ¿Qué efecto tendría utilizar una pipeta mal calibrada en la realización de esta práctica?
Pues que no se pipetearía correctamente, y las cantidades probablemente serían incorrectas por lo que luego podría apreciarse al añadir agua.
