CULTIVO CELULAR

OBJETIVO

El objetivo de esta práctica fue el de afianzar conocimientos, ya que habíamos realizado cultivos celulares previamente. Además aprovechamos la previa limpieza de la cabina de flujo laminar para realizar dicho cultivo.

Material necesario:

• Gradillas.
• Pipetas estériles de vidrio
• Auxiliar de pipeteado
• Vaso de precipitados
• Eppendorfs
• Tubos de ensayo
• Micropipetas
• Puntas de micropipeta
• Frascos de Roux
• Microscopio invertido
• Camara de Nebauer
• Contador de células

Reactivos

• Medio de cultivo
• Colorante azúl tripán

PROCEDIMIENTO

• En primer lugar nos dirigimos al congelador de -70 ºC y cogimos unas células que estaban congeladas, en dicha etiqueta databa del año 2016.

• Para descongelarlas empleamos el baño María donde la pusimos a una temperatura de 37ºC
• Una vez alcanzada la temperatura las pusimos en la cabina de flujo laminar
• IMPORTANTE: siempre rociar con alcohol de 70 ºC antes de introducirla en la cabina de flujo al igual que las manos del operador.
• Tras ello con ayuda de una pipeta de 10 mL pipeteamos 5 mL de medio de cultivo y lo pusimos en dos tubos Falcón (5 mL en cada uno), además los tubos Falcón lo pusimos unos segundos en el baño María ya caliente debido a que no sufriera las células un cambio grande de temperatura al introducirlas en el medio.

• Una vez algo más calentado el medio de cultivo, volcamos las células sobre el medio de cultivo y se resuspende con la misma pipeta. (la cantidad de cultivo es de un mL aproximadamente). Esto se realizó en un tubo Falcon, en el otro se dejó solo el cultivo
• Tras ello cogimos 3 mL del Falcon con células y la depositamos en un frasco de Roux, además de 2,5 mL del Falcon con medio solo; es importante recalcar que para depositarlo en dicho frasco lo pongamos un poco inclinado pero no completamente perpendicular.
• Cerramos el frasco de Roux

• Tras ello observamos en el microscopio invertido los resultados, y vimos que había multitud de células.

Podemos observar gran cantidad de células

• Seguidamente se introdujo los frascos en la incubadora de CO2, la cual pudimos observar que no tenía agua, así que la llenamos, y dejamos allí el cultivo. IMPORTANTE: desenroscar un poco el tapón del frasco de Roux al introducirlo en la incubadora de CO2.

• Mientras tanto pensamos en realizar una tinción de las células, como ya sabíamos previamente, la tinción con azul tripán nos dará como resultado que; las células blancas son las vivas y las azules son las muertas.
• Para realizar la tinción primero pipeteamos 200 µL de cultivo celular y lo depositamos en dos tubos eppendorfs, lluego pipeteamos 10 µL de azul tripán en dos tubos eppendorfs y en otros dos depositamos 20 µL. Así respectivamente en los primeros se introdujo 30 µL de cultivo celular y en los segundos se introdujo 20 µL de cultivo celular. De esta forma tendríamos los dos tubos primeros diluidos al 1/4 (factor de dilución 4) y los dos últimos diluidos al 1/2 (factor de dilución 2).

• Tras ello guardamos de nuevo el cultivo celular en la incubadora.
• Posteriormente y con ayuda de una micropipeta pasteur cogimos una pequeña cantidad del de factor de dilución 4 y lo pusimos en la cámara de Neubauer, con el de factor de dilución 2.
• Seguidamente se observó la cámara de Nebauer al microscopio electrónico y observamos en uno multitud de células vivas, aunque también algunas muertas y además en el otro no salió tantas células pero pudimos observar protozoos.

Protozoo observado al microscopio

Microorganismo no identificado.

RECUENTO CELULAR

• Para realizar esto usamos el microscopio electrónico y fuimos haciendo el recuento del cuadro.
• Además nos valimos de un contador de células. 
• Los resultados fueron:
• 9 células vivas
• 11 células muertas
• El factor de dilución es 2

Para realizar el recuento, tras contar las células ayudándonos con nuestro contador, a través de las siguientes fórmulas obtuvimos los siguientes resultados: (además también calculamos la viabilidad)