SOUTHERN BLOT

OBJETIVO

Nuestro objetivo era el de familiarizarnos con las técnicas de hibridación, más concretamente con la Southern blot, la cuál consiste en identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel y transferirlos a una membrana de nitrocelulosa o nailon. En este caso se usa como herramienta para una prueba de “huella genética” en un caso hipotético de determinación de paternidad.
Esta técnica, además, permite la detección simultánea de varias secuencias diana de distintos tamaños con una única hibridación, y se suelen usar sondas radiactivas aunque pueden emplearse otros marcajes distintos.


MATERIAL NECESARIO

• A Fragmentos estándar de ADN    
• B ADN madre cortado con enzimas de restricción 
• C ADN Hijo cortado con enzimas de restricción  
• D ADN padre 1 cortado con enzimas de restricción
• E ADN padre 2 cortado con enzimas de restricción 

NOTA: El ADN debe conservarse a -20ºC

Muestras de ADN.

• Practice Gel Loading Solution  
• Tampón de electroforesis 50X 
• Bote de Blue –Blot DNA Stain Solution 10 X  
• Membrana de Nylon 7 x 7 cm 
• Papel de filtro para el bloting 7 x 7 cm 
• Agarosa 
• Pipetas de transferencia  
• Pipetas de 1 ml estériles  
• Probeta 100 ml 

NOTA: A Temperatura ambiente

• Aparato de electroforesis horizontal
• Fuente de energía para la electroforesis.
• Sistema de visualización del ADN
• Bandeja para la tinción.
• Baño de agua.
• Estufa o incubador 80ºC.
• Micropipetas automáticas y puntas.
• Microtubos y tubos de 10 ml.
• Placa calefactora o microondas.
• Agua destilada
• NaCl.
• NaOH
• HCl concentrado.
• Plástico para envolver y papel secante.

DESCRIPCIÓN

Lo que se hizo fue obtener del kit ADN de 2 posibles padres, esas muestras de ADN fueron digeridos con la mismo enzima de restricción en reacciones separadas. El objetivo de la prueba es determinar quién es el padre del hijo mediante el análisis y emparejar el patrón de fragmentación del ADN después de la electroforesis en gel de agarosa. 

El experimento se divide en 3 partes:

1. Electroforesis gel de agarosa.
2. Transferencia Southern Blot.  
3. Detección del ADN. 

Debemos tener en cuenta que la electroforesis debería pararse cuando el colorante naranja de carga haya migrado aproximadamente 4,5 cm desde el pocillo de siembra del gel de agarosa.

Las preparaciones previas de reactivos se pueden hacer el día previo o el día de la práctica y puede llevar aproximadamente 1h 30’. 3. Se requieren 90 minutos para preparar los procedimientos de transferencia de Southern Blot, la cual tiene lugar durante toda la noche. Al día siguiente el blot se desmonta y se incuba durante 30 minutos. 4. La detección del ADN requerirá aproximadamente 25 minutos para la tinción y destinción.

 Precauciones

1. Llevar gafas y guantes de laboratorio mientras se trabaja. 
2. NO PIPETEAR CON LA BOCA, utilizar los dispositivos adecuados. 
3. Extremar las precauciones cuando se trabajan con equipos que utilizan conjuntamente calor y mezcla de reactivos. 
4. Lavarse las manos con jabón y agua después de haber trabajado en el laboratorio o utilizado reactivos o materiales biológicos.

PRÁCTICA

1. Electroforesis en gel de agarosa.

Lo primero que hicimos fue hacer un gel de agarosa al 0,8% de 7 x 10 cm, para ello se necesitan hacer al menos 6 pocillos que contengan 40 µL.
Unos compañeros realizamos para la clase el tampón TBE para el gel, el que disponíamos era del 20x y lo queríamos rebajar al 1x lo que hicimos fue mezclar 100 mL de tampón TBE 20x con 900 mL de agua destilada, para lo que necesitamos de una probeta y una varilla.
Posteriormente cada grupo cogió su parte correspondiente, así que cogimos 42 mL de TBE ya al 1x y se pesó 0,40 gramos de agarosa y se añadió, se agita con ayuda de una varilla, para medir dichos volumen se requirió de una probeta y una pipeta pasteur.
El siguiente paso fue pasar el tampón a un vaso de precipitados y se añadió un minuto al microondas, este tiempo fue suficiente para que quedase transparente.
Seguidamente se dejó enfriar hasta 55ºC para ello colocamos el vaso a la vez que agitamos debajo del grifo.

Agarosa

Preparación para todos los grupos del tampón TBE 1x

NOTA: Es importante usar guantes cuando lo saquemos del microondas para evitar quemaduras.

Lo próximo fue verter el gel sobre el molde con el peine ya acoplado, y esperar hasta que solidifique.
Tardó bastante en solidificar, sobre unos 20 o 25 minutos y los últimos 5 minutos hubo que meterlo en la nevera para acelerar el proceso.

Mientras tanto en el baño se calentó un vaso a 65ºC para calentar las muestras que contienen el ADN antes de su siembra. A 65ºC las agregaciones no específicas que se pueden generar por los extremos cohesivos generados por los enzimas de restricción son eliminadas. Se calentaron las muestras A-E a 65ºC durante 2 minutos y se dejaron enfriar las muestras otros 2 minutos. Es muy importante marcar los microeppendorfs que contienen las muestras con las letras correspondientes de cada paciente para evitar confusiones.

Se pone el gel de agarosa, ya solidificado, y con mucho cuidado de que no se rompa en la cubeta de electroforesis, con los pocillos orientados al lado negativo (negro). Y llenar la cubeta con tampón de carga hasta cubrir el gel.

Colocación del gel en la cubeta.

Posteriormente se procedió a la siembra de las muestras A-E en los pocillos consecutivos, la cantidad debía ser entre 35-38 µL. Aquí tuvimos un error en el primer gel que se usó porque usemos unos pocillos muy pequeños por lo que al depositar las muestras con la micropipeta se salió parte de las muestras, dicho gel quedó inservible, y se procedió a hacerlo en otros geles, pero con una cantidad de muestra menor, finalmente se emplearon solo 10 µL.

Finalmente solo fueron necesarios dos geles, puesto que tampoco había suficiente cantidad de muestra.

El siguiente paso es la realización de la electroforesis, para ello se configura la fuente de alimentación a un voltaje de 150W unos 35 minutos (cuando se corrieron las muestras unos 4,5 cm aproximadamente por el gel). Una vez terminada se procede con el análisis de Southern Blot. La electroforesis se paró cuando el colorante naranja de carga haya migrado aproximadamente 4,5 cm desde el pocillo de siembra del gel de agarosa.


2. Análisis del southern blot.

Durante este proceso se transferirán los fragmentos de ADN desde el gel de agarosa a la membrana de nylon. Después, la membrana será incubada durante un periodo corto de tiempo para fijar el ADN a la membrana. Para evitar reactivos tóxicos, y especialmente los radioactivos, que son utilizados en el Southern, en este experimento se utilizará un sistema de detección no isotópico.

• Desnaturalización.

Después de la electroforesis, el gel es secuencialmente tratado con HCl y NaoH. 

El HCl introduce sitios apurínicos en el ADN lo cual produce uniones fosfodiester e introduce “nicks” en el ADN de doble cadena.

El tratamiento con NaOH rompe los puentes de hidrógeno entre las bases.

El secuencial tratamiento ácido/base resulta en la formación de pequeños fragmentos que facilita la trasferencia de los fragmentos de ADN en la membrana de nylon

1. Tras sacar el gel de la electroforesis se coloca en una cubeta con 100 ml de 0,25N HCl. y se incubó a temperatura ambiente durante 8 minutos. El gel debe estar completamente cubierto con la solución y agitar periódicamente, para ello empleemos un agitador. Luego, se elimina con cuidado la solución, que no se podrá reutilizar. 
2. Se lava el gel con diversos cambios de 100 ml de agua destilada.Colocar el gel durante 15 minutos en la solución de Desnaturalización del ADN (0,5 M NaOH/0,6 M NaCl). El gel debe estar completamente cubierto con la solución y agitar periódicamente, también se usó el agitador. Eliminar la solución. 
3. Utilizar otros 100 ml de Solución de Desnaturalización e incubar otros 15 minutos. He de añadir que se conservó esta solución para usarla más adelante.

Como este día ya tuvimos que irnos, se guardó el gel en la nevera hasta el día siguiente.

Agitador

3. Configuración de la transferencia del southern blot

Cogimos una cubeta y en ella se pusieron  unas hojas de papel de aluminio.

Sacamos el gel con sumo cuidado e invirtiendo el gel (los pocillos hacia abajo), lo pusimos en la superficie lisa de forma que quede en contacto con la membrana de transferencia. 

Con la ayuda de guantes, con pinzas y tijeras se ajustó la membrana de nylon al tamaño del gel. Es muy importante la utilización de guantes porque aquellas zonas que sean tocadas sin ellos dejarán residuos de aceite y no permitirán unir el ADN durante la transferencia. 

Luego se coge con mucho cuidado la membrana por los extremos con 2 pinzas y ligeramente doblada en el centro y lentamente se humedece (desde la mitad hacia afuera) con la solución de Desnaturalización que guardamos antes.

Se libera la membrana y sumergir suavemente durante 5 minutos en la solución de desnaturalización. Utilizando unas pinzas se sacamos la membrana saturada de la solución de desnaturalización y colocarla encima del gel de agarosa.

 Es MUY IMPORTANTE que entre los diferentes elementos no queden burbujas de aire, por lo que se vigiló que no ocurriese, alisando la superficie suavemente con una varilla

Luego se usó el papel de filtro de blotting del mismo tamaño del gel y la membrana de nylon y se pone encima de ésta.

Luego, cuidadosamente, se coloca un montón de papel absorbente 4-5 cm de grosor encima del filtro de “blotting”y para hacer peso colocamos encima una placa de cristal con otros objetos encima. Y así lo dejamos el fin de semana.

Tras llegar el lunes quitamos la placa de vidrio, pesos y papeles absorbentes y con guantes y pinzas le dimos la vuelta al conjunto (gel-nylon-papel de filtro) de forma que descanse sobre el papel de filtro. Luego con un rotulador se dibujaron los seis pocillos de la muestra y se rastreó sus posiciones en la membrana de nylon.

Utilizando pinzas separamos el gel de la membrana. El gel puede ser descartado y se observará que está deshidratado. 

Poner la membrana encima de un montón de papel seco con el ADN hacía arriba (el lado que estuvo en contacto con el gel). 

Marcar la membrana por el lado del ADN con el nº de grupo.

Luego se secó y fijó el ADN completamente a la membrana. Para ello empleamos un horno en el que lo pusimos a 80ºC durante 30 minutos, con la membrana colocada entre dos papeles de filtro.

Dispositivo de transferencia

4. Detección no isotópica del ADN.

Durante este proceso se podrá visualizar el ADN en la membrana.
Para la detección empleamos el Blue Blot DNA Stain, el cuál es un reactivo no isotópico, que elimina los problemas asociados al uso de isótopos radiactivos.
Para ello colocamos la membrana con el ADN en 100 ml de la solución diluida de “Blue Blot DNA Stain” durante 10-15 minutos.
Se saca la membrana con pinzas y colocar en 200 ml de agua destilada.
Cambiamos el agua destilada 3 o 4 veces hasta que la membrana quedó desteñida y las bandas de ADN se hicieron algo visibles.

Membrana sumergida en Blue Blot DNA Stain.

Blue Blot DNA Stain

RESULTADOS

El resultado no fue del todo bien, puesto que se vieron algunas bandas, la de la primera, y algunas de los dos padres, pero no eran demasiado claras por lo que se quedó en volver a repetir el experimento