En esta práctica, experimentamos con la herramienta BLAST bioinformatics.
En donde leímos las autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles para su posterior análisis de los datos resultantes utilizando las bases de datos disponibles al público (BLAST) para identificar los genes y productos genéticos.
Material necesario
- Ordenador con acceso a Internet
- Caja de luz blanca
- Autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles (3 grupos de 4 autorradiografías)
FUNDAMENTO
La tecnología de secuenciación del ADN permite el análisis del ADN a nivel de nucleótidos.
Los nucleótidos son los bloques de construcción de monómeros de ADN.
Cada desoxinucleótido (dNTP) comprende tres partes básicas: un grupo fosfato, un azúcar desoxirribosa, y una base que contiene nitrógeno (adenina, citosina, guanina, o timina). El 3' grupo hidroxilo en el azúcar de un nucleótido forma un enlace covalente con el 5' grupo fosfato de su vecino.
La naturaleza de esta unión resulta en cadenas muy estables con una polaridad distinta, haciendo del DNA una estructura ideal para almacenamiento de información genética.
Los métodos de secuenciación automatizados de alto rendimiento han hecho que la información obtenida en la generación de secuencias sea mucho más eficiente.
Uno de los principales objetivos en la bioinformática es el desarrollo de programas informáticos que permiten el acceso más eficiente y la gestión de grandes conjuntos de datos.
PROCEDIMIENTO
Lo primero que hicimos fue aprender a utilizar la página web siguiendo las instrucciones detalladas en el protocolo que se nos proporcionó.
La página que usamos es BLASTN.
PRÁCTICA
Para ello realizamos varios ejercicios
EJERCICIO 1
- El primero consistió en familiarizarse con la autorradiografía mediante la lectura de la secuencia de ADN de la muestra 1.
 |
| Autorradiografías |
Para ello comenzamos en la flecha que había impresa en la autorradiografía y leímos de abajo hacia arriba el gel durante 20 nucleótidos. (Es importante recordar que se debe realizar siempre la lectura de abajo a arriba).
Acto seguido escribimos la
secuencia de ADN en la página y se buscó la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el
programa BLASTN.
Seguidamente realizamos otra lectura comenzando en la flecha y leer hacia arriba el gel durante 30 nucleótidos. Escribimos la
secuencia de ADN y se volvió a buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el
programa BLASTN.
Con los resultados obtenidos de la autorradiografía responder a las siguientes
preguntas:
¿Los resultados obtenidos con BLASTN para la primera y la segunda
búsqueda se parecen entre sí?
Las secuencias encontradas fueon casi idénticas para la primera y segunda búsqueda, pero los valores más altos fueron para la segunda búsqueda.
Mus caroli y Mus pahari.
¿Cuál es el nombre de este gen?
Factor de replicación C.
Esta fue la secuencia de 20 nucleótidos:
Y esta fue la secuencia de 30 nucleótidos:
¿A qué organismo es probable que pertenezca la secuencia de ADN de este ejercicio?
Factor de replicación C.
Esta fue la secuencia de 20 nucleótidos:
¿A qué organismo es probable que pertenezca la secuencia de ADN de este ejercicio?
Mus musculus (Ratón doméstico).
RECOMENDACIONES A TENER EN CUENTA:
- Se puede introducir la secuencia directamente en el cuadro de consulta o escribir la secuencia en un pedazo de papel y luego introducirla en el cuadro de busqueda, a preferencia del usuario.
- Es muy importante no confundir los carriles cuando lea la secuencia. El gel contiene los carriles A, C, G y T de izquierda a derecha.
- La lectura de un gel de secuenciación requiere que leer los nucleótidos en la dirección 5’→3’. Esto se puede lograr mediante la lectura hacia "arriba" del gel (a partir de la parte inferior del gel a la parte superior).
- Observar que la separación y la intensidad de la mayor parte de las bandas es bastante constante. Debemos ignorar las bandas de colores claros y elegir los sólo el de los más oscuros. Alguna vez, la secuencia será oscura y los cuatro carriles serán de intensidad relativamente similares. Esto se llama una compresión de la secuencia de ADN y es común cuando hay tramos de G y C. Este tipo de patrón debe ser tratado como una posición ambigua, ante esta situación puede introducirse una N que indica que podría ser cualquiera de las bases.
EJERCICIO 2
A continuación realizamos otro ejercicio con la tira 2.
Para ello comenzamos a leer desde 6 cm desde la parte inferior de la tira.
Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN, como en el ejercicio anterior.
Después de obtener los resultados fuimos hacia abajo a
la sección de Alineamiento y observamos las entradas que tienen nucleótidos que coinciden
con su secuencia de consulta.
Esto fue el resultado:
EJERCICIO 3
En este ejercicio leímos la secuencia de ADN de la muestra 3.
Igualmente comenzamos a leer desde la parte inferior de la
banda y escribir la secuencia de ADN.
Se buscó la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
A continuación hicimos clic en el número de acceso de GenBank de la secuencia hit para acceder a
más información sobre la secuencia de ADN.
Los resultados fueron los siguientes:
Los resultados fueron los siguientes:
Con los resultados obtenidos de la autorradiografía responder a las siguientes
preguntas:
¿Cuál es el nombre de este gen?
Rho GTPasa activadora de la proteína 5
¿Cuántas pares de bases, aproximadamente, tiene este gen?
7933 pb.
EJERCICIO 4
En este caso se mostró la interacción de dos proteínas codificadas por dos genes. Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel fundamental en prácticamente todos los procesos en una célula viva.
Este proceso, llamado transducción de señales, es muy importancia en muchos procesos biológicos tales como la división celular y la formación del citoesqueleto celular.
En este ejercicio, usamos secuencias de ADN para caracterizar dos genes humanos
Lo primero que se realizó fue leer la secuencia de ADN obtenido de la muestra 4 y se comenzó desde la parte inferior de la banda y pusimos alrededor de 30 pares de bases de la secuencia de ADN.
A continuación, subimos alrededor de un tercio de la altura de la tira (aproximadamente 14 cm) y leímos una parte de esta sección de la secuencia de ADN.
Pero en este caso se limitó la búsqueda a la base de datos de genes humanos. Para ello cambiamos la opción de "Choose Search Set” (Elija conjunto de búsqueda) y seleccionamos "Human genomic + transcript” (Genóma humano + transcripción).
Buscar cada sección de la secuencia de forma individual en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Resultados con 30 pares de bases
Resultados a partir de los 14 cm
A partir de los resultados obtenidos:
Este ejercicio contiene dos secuencias de ADN (desde la sección inferior y a partir de la sección central). ¿Cuáles son los nombres de los genes correspondientes a estas dos secuencias?
La primera secuencia de ADN es la de Bai1.
La segunda secuencia es la de Rac1.
¿Cuáles son las funciones de las dos proteínas codificadas por estos genes?
La secuencia Bai1 codifica BAI1, el cuál es un inhibidor de la angiogénesis específica del cerebro.
La angiogénesis implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes, es un proceso normal en el crecimiento, desarrollo y cicatrización de heridas.Pero, la angiogénesis también ha demostrado ser esencial para el crecimiento y la metástasis de tumores sólidos. Con el fin de obtener el suministro de sangre para su crecimiento, las células tumorales son potentemente angiogénicas. La BAI1 se cree que inhibe el nuevo crecimiento de las células de los vasos sanguíneos, por lo que suprime el crecimiento de los glioblastomas (tumores cerebrales malignos). La BAI1 también se cree que funciona en la adhesión celular y transducción de señales en el cerebro. La secuencia Rac1 codifica una pequeña GTPasa llamada RAC1. La RAC1 actúa como un interruptor molecular en las vías de señalización que pueden cambiar la transducción de señales hacia dentro y fuera de una célula. La RAC1 está activo u "ON" cuando se une a una GTP e inactiva u "OFF" cuando se une con a un PIB. La forma inactiva de RAC1 (PIB-forma) se activa mediante el intercambio de GDP por GTP por los factores de cambio de nucleótidos de guanosina (GEFs). La inactivación de la RAC1 se consigue mediante la activación de las proteínas GTPasa (GAP), que revierten la conformación de nuevo a la forma inactiva unida a GDP a través de la hidrólisis del GTP.
¿Cómo interactúan estas dos proteínas en una célula viva?
En una célula viva, después que la RAC1 se activa mediante la unión de GTP, interactúa con BAI1. Esta interacción en la membrana citoplasmática es crucial para la función de BAI1, ya que se cree que participa en el crecimiento neuronal. La BAI1 también se asocia con otros efectores derivados de las proteínas G Rho pequeñas, que se asocian con la formación de fibras y la citocinesis.
PREGUNTAS DE INTERÉS
¿Qué es una secuencia de ADN?
¿Qué representa cada banda en una autorradiografía?
Representa los distintos nucleótidos que pueden ser, uno por banda, por ejemplo si en una banda pone A, significa que corresponde a la adenina.
¿Qué es el programa BLAST? ¿Por qué se le considera una herramienta bioinformática?
Es un programa informático de alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN, ARN o de proteínas. El programa es capaz de comparar una secuencia problema (también denominada en la literatura secuencia query) contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en una base de datos. El algoritmo encuentra las secuencias de la base de datos que tienen mayor parecido a la secuencia problema. Es importante mencionar que BLAST usa un algoritmo heurístico por lo que no nos puede garantizar que ha encontrado la solución correcta. Sin embargo, BLAST es capaz de calcular la significación de sus resultados, por lo que nos provee de un parámetro para juzgar los resultados que se obtienen.
Se le considera una herramienta bioinformática porque nos permite utilizarla para comparar secuencias, ya que hacemos empleo de una herramienta informática para el análisis de datos biológicos.
En este caso se mostró la interacción de dos proteínas codificadas por dos genes. Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel fundamental en prácticamente todos los procesos en una célula viva.
Este proceso, llamado transducción de señales, es muy importancia en muchos procesos biológicos tales como la división celular y la formación del citoesqueleto celular.
En este ejercicio, usamos secuencias de ADN para caracterizar dos genes humanos
Lo primero que se realizó fue leer la secuencia de ADN obtenido de la muestra 4 y se comenzó desde la parte inferior de la banda y pusimos alrededor de 30 pares de bases de la secuencia de ADN.
A continuación, subimos alrededor de un tercio de la altura de la tira (aproximadamente 14 cm) y leímos una parte de esta sección de la secuencia de ADN.
Pero en este caso se limitó la búsqueda a la base de datos de genes humanos. Para ello cambiamos la opción de "Choose Search Set” (Elija conjunto de búsqueda) y seleccionamos "Human genomic + transcript” (Genóma humano + transcripción).
Buscar cada sección de la secuencia de forma individual en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.
Resultados con 30 pares de bases
Resultados a partir de los 14 cm
A partir de los resultados obtenidos:
Este ejercicio contiene dos secuencias de ADN (desde la sección inferior y a partir de la sección central). ¿Cuáles son los nombres de los genes correspondientes a estas dos secuencias?
La primera secuencia de ADN es la de Bai1.
La segunda secuencia es la de Rac1.
¿Cuáles son las funciones de las dos proteínas codificadas por estos genes?
La secuencia Bai1 codifica BAI1, el cuál es un inhibidor de la angiogénesis específica del cerebro.
La angiogénesis implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes, es un proceso normal en el crecimiento, desarrollo y cicatrización de heridas.Pero, la angiogénesis también ha demostrado ser esencial para el crecimiento y la metástasis de tumores sólidos. Con el fin de obtener el suministro de sangre para su crecimiento, las células tumorales son potentemente angiogénicas. La BAI1 se cree que inhibe el nuevo crecimiento de las células de los vasos sanguíneos, por lo que suprime el crecimiento de los glioblastomas (tumores cerebrales malignos). La BAI1 también se cree que funciona en la adhesión celular y transducción de señales en el cerebro. La secuencia Rac1 codifica una pequeña GTPasa llamada RAC1. La RAC1 actúa como un interruptor molecular en las vías de señalización que pueden cambiar la transducción de señales hacia dentro y fuera de una célula. La RAC1 está activo u "ON" cuando se une a una GTP e inactiva u "OFF" cuando se une con a un PIB. La forma inactiva de RAC1 (PIB-forma) se activa mediante el intercambio de GDP por GTP por los factores de cambio de nucleótidos de guanosina (GEFs). La inactivación de la RAC1 se consigue mediante la activación de las proteínas GTPasa (GAP), que revierten la conformación de nuevo a la forma inactiva unida a GDP a través de la hidrólisis del GTP.
¿Cómo interactúan estas dos proteínas en una célula viva?
En una célula viva, después que la RAC1 se activa mediante la unión de GTP, interactúa con BAI1. Esta interacción en la membrana citoplasmática es crucial para la función de BAI1, ya que se cree que participa en el crecimiento neuronal. La BAI1 también se asocia con otros efectores derivados de las proteínas G Rho pequeñas, que se asocian con la formación de fibras y la citocinesis.
PREGUNTAS DE INTERÉS
¿Qué es una secuencia de ADN?
Es una sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda, con la capacidad de transportar información.
Las letras son A, C, G, y T, que simbolizan las cuatro subunidades de nucleótidos de una banda ADN, adenina, timina, citosina y guanina. que son bases covalentemente ligadas a cadenas fosfóricas. En el típico caso, las secuencias se presentan pegadas unas a las otras, sin espacios, como en la secuencia AAAGTCTGAC, yendo de 5' a 3' de izquierda a derecha.
¿Qué representa cada banda en una autorradiografía?
Representa los distintos nucleótidos que pueden ser, uno por banda, por ejemplo si en una banda pone A, significa que corresponde a la adenina.
¿Qué es el programa BLAST? ¿Por qué se le considera una herramienta bioinformática?
Es un programa informático de alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN, ARN o de proteínas. El programa es capaz de comparar una secuencia problema (también denominada en la literatura secuencia query) contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en una base de datos. El algoritmo encuentra las secuencias de la base de datos que tienen mayor parecido a la secuencia problema. Es importante mencionar que BLAST usa un algoritmo heurístico por lo que no nos puede garantizar que ha encontrado la solución correcta. Sin embargo, BLAST es capaz de calcular la significación de sus resultados, por lo que nos provee de un parámetro para juzgar los resultados que se obtienen.
Se le considera una herramienta bioinformática porque nos permite utilizarla para comparar secuencias, ya que hacemos empleo de una herramienta informática para el análisis de datos biológicos.
No hay comentarios:
Publicar un comentario